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Q1：目前什么物种可以进行lncRNA测序？ 

A1：具有参考基因组序列的动植物等均可进行lncRNA测序。 

Q2：从total RNA中富集lncRNA为什么采用去rRNA的方式？ 

A2：细胞内的lncRNA约80%不具有polyA尾结构，无法用oligo(dT)磁珠的方法调取得到完整的lncRNA , 采用去rRNA的方式可以虽然会同时收集得到mRNA，但这样操作可以得到完整的lncRNA片段。 

Q3：为什么需要链特异测序而不是普通的cDNA测序？ 

A3：链特异有助于威九国际确定转录的方向，并使得反义转录本的定量更为准确。 

Q4：lncRNA-seq中的数据lncRNA与mRNA的比例各占多少？ 

A4：一般来说，一个样品中lncRNA与mRNA的种类在同一个数量级，但由于lncRNA有较强的组织特异性，lncRNA的数据可能比mRNA略多；但由于lncRNA通常为低表达，因此被测序测到的几率较小，更多的reads是来自于mRNA的，所以威九国际推荐客户在做lncRNA项目的同时，也可以利用同一套测序数据进行mRNA的分析。 

Q5：怎么用分子生物学实验的方法验证生物信息分析结果？ 

A5：因为转录组组装的复杂性，威九国际推荐客户用传统的克隆或者PCR的方法验证分析结果，差异表达的lncRNA亦可以用RT-PCR的方式进行验证。

Q6：FPKM与RPKM的区别是什么？ 

A6：这两种定量单位基本是一回事。RPKM表示每百万reads中比对到转录本每千个碱基的数量，FPKM表示每百万比对片段中比对到转录本每千个碱基的数量。在RNA-seq中，转录本的丰度是由该转录本cDNA片段的数量度量的，双端测序每个片段将产生两个reads，但并不代表两个reads都能比对上，比如其中一条reads的测序质量比较差。如果威九国际统计的是reads数量而不是比对片段的数量，那么一些片段将会被统计两次，由此对定量的估计会造成一定偏差，所以FPKM统计的片段而不是reads数量。 

Q7：Cuffdiff与其他统计差异表达工具的区别是什么？ 

A7：大部分差异表达工具包都是靠统计不同条件下，每个样品每个基因的比对片段数量寻找差异，并计算差异的显著性。这种方法只在该基因在基因组上只有一个拷贝，且只有一个转录本的情况下表现良好。但是在面对有多个转录本的基因是，通常不可能确切地分辨每一个比对片段是来自哪一个转录本。而Cuffdiff在做差异表达基因分析的时候，将基因的每一个转录本的表达都加起来用以衡量不同条件下每个基因的表达水平。