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9月，博云客户北理工霍毅欣教授团队在Nature Communications发表有关建立基于稀有密码子的氨基酸高产菌株筛选策略的研究论文，该研究为氨基酸高产机制的解析与高产菌株的构建提供了创新思路。

关键词  氨基酸高产菌、 稀有密码子、转录组测序、合成通路

目前，全球氨基酸市场呈现逐年增长的趋势，年均复合增长率维持在5.6%左右，2016年全球氨基酸年产量已达到800万吨，总销售额近百亿美元。微生物发酵方法因其产能高、成本低等优势，生产了全球总产量85%以上的氨基酸。如何筛选、改造和获得氨基酸高产菌株是提高发酵产量的关键问题。

针对这一需求，北理工生命学院霍毅欣教授团队利用自然界中普遍存在的“密码子偏好性”规律，开发了一种不依赖于类似物的氨基酸高产菌株的筛选方法。不同于利用“密码子优化”提升异源蛋白的表达量，作者通过将必需基因及颜色蛋白编码基因中的密码子替换为其稀有形式，人为提高了蛋白翻译对氨基酸含量要求的“门槛值”，实现了高效、快速的氨基酸高产菌株筛选，作者在大肠杆菌（E.coli）和谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum）两种常用氨基酸生产菌种中验证了这种筛选方法。

一种氨基酸最多对应6种不同的密码子，根据核酸序列中密码子出现频率的不同，使用频率较低的密码子被称为稀有密码子，实验证明大肠杆菌中翻译稀有密码子的tRNA浓度同样很低。细胞的翻译过程需要tRNA与氨基酸进行氨酰化连接，进而将氨基酸正确的插入到肽链中。在氨基酸总量有限的情况下，这类稀有tRNA难以在与其他tRNA的竞争中夺取到足够的氨基酸，常处于“空载”状态，这就导致翻译过程中稀有密码子编码段翻译速率的下降甚至停滞，只有在胞内氨基酸浓度大幅提升并使大部分tRNA维持“满载”时，稀有tRNA才有机会捕获到剩余的氨基酸，从而保证稀有密码子编码段的正常翻译。

图1 稀有密码子减缓翻译速率及恢复方式

基于稀有密码子的翻译特性，作者分别将抗性基因（kan^R和spec^R）和颜色蛋白编码基因（gfp和ppg）中的不同氨基酸密码子替换为对应的稀有密码子，建立了以生长水平和颜色标记为指示的两类筛选体系。以亮氨酸为例，将卡那霉素抗性基因kan^R中的亮氨酸密码子替换为其稀有形式CTA后，在含有卡那霉素的稀释LB培养基中，这一蛋白的翻译过程显著受阻，细胞难以合成足够量的解毒蛋白，菌体浓度显著下降。而外源补加L-亮氨酸后，稀有密码子CTA对应的tRNA得以被额外的L-亮氨酸“装载”，从而驱动了由稀有密码子编码的抗性蛋白的翻译，菌体生长得以恢复。这种“抑制-回补”现象证明了氨基酸含量与稀有密码子编码蛋白的翻译速率存在正相关性，即氨基酸浓度的提高可以促进“逆向优化”基因的表达。

图2 补加氨基酸可以缓解稀有密码子的影响

利用稀有密码子与氨基酸浓度之间的关系，作者成功从大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的突变库中分别筛选出亮氨酸、精氨酸和丝氨酸高产菌株，并针对两株亮氨酸高产大肠杆菌进行了转录组和基因组测序，通过比较分析得到野生型E.coli及亮氨酸高产菌株LP-4、LP-7的差异表达基因，这些基因与支链氨基酸合成密切相关。最终发现突变菌株胞内亮氨酸浓度的提高得益于其合成和吸收途径的增强以及外排能力的减弱。此外，该系统的筛选压力可以通过改变启动子强度、质粒拷贝数和稀有密码子的数量进行调节。研究还发现替换不同的稀有密码子对序列翻译的影响强度各不相同，极端情况下，即使养分充足，富含稀有密码子的基因也无法实现正常翻译，这也为稀有密码子对mRNA稳定性的影响提供了新的论据。

图3 转录组分析基因表达变化

这一基于稀有密码子的全新筛选策略解决了氨基酸类似物筛选法面临的诸多问题，筛选过程仅需引入一种指示基因，对菌株的遗传背景无任何改变，筛选过程不产生毒害，理论上可适用于任何氨基酸高产菌株的筛选，将极大促进氨基酸发酵产业的发展。

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