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标题：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA（外泌体传送的lncARSR在肾癌中以ceRNA的方式促进舒尼替尼耐药性）

杂志：Cancer Cell

影响因子：27.407

关键词：lncRNA、sunitinib resistance、renal cancer、ceRNA 

Problem

舒尼替尼（Sunitinib），是最常用的肾细胞癌临床治疗选择。然而，临床数据显示，有10%-20%的病人显示出对舒尼替尼的耐药性。

Abstract

舒尼替尼耐药性对晚期肾细胞癌具有巨大的挑战性。理解基本的机制和发展对舒尼替尼耐药性的有效策略在临床诊断中十分急迫。研究者们确定了一种lncRNA，取名叫lncARSR（lncRNA Activated in RCC with Sunitinib Resistance，在肾癌细胞中被舒尼替尼耐药性激活的lncRNA）,这个lncRNA与舒尼替尼临床不良反应密切相关。在肾癌细胞中，lncARSR竞争性结合miR-34/miR-449并促进facilitate AXL和c-MET表达来提高舒尼替尼耐药性。此外，具有生物活性的lncARSR可以进入外泌体并转运到敏感细胞中，因此可以传播舒尼替尼耐药性。在肾癌细胞舒尼替尼耐药性治疗中，带锁核酸靶向的lncARSR或AXL / c-Met抑制剂修复了舒尼替尼反应。因此，lncARSR可以作为一种预测和舒尼替尼耐药性的潜在治疗靶点。

研究亮点

1、lncARSR促进舒尼替尼耐药性并预测肾癌患者不良反应。

2、lncARSR在肾癌细胞间以外泌体形式转移并传播舒尼替尼耐药性。

3、lncARSR通过ceRNA方式竞争性结合miR-34/miR-449并促进AXL和c-Met的表达。

4、靶向沉默lncARSR或AXL/cMet可恢复肾癌细胞的药物敏感性。

Methods

芯片分析：RNA表达分析采用安捷伦人lncRNA + mRNA芯片V.2.0 (GPL18109)；

Northern blot/Western blot/PCR验证；

RACE实验；

免疫组化(IHC)、基于原位杂交的LNA(LNA ISH)、荧光原位杂交(FISH)；

外泌体实验；

RIP、荧光素酶报告实验等。

Results

1.LncARSR 在舒尼替尼耐药的肾癌细胞中高表达

首先，通过裸鼠转移模型，筛选出耐药细胞系——7Su3rd和ACSu3rd。此时分为耐药组和敏感组两组，通过lncRNA表达谱芯片筛选差异lncRNA，然后通过RT-PCR和异种移植实验进行验证，发现了24个差异lncRNA, 其中8个上调。然后，对8个上调lncRNA进行敲除实验，发现只有lncARSR恢复了药物敏感性。这里便确定了此文章的研究对象——lncARSR——一个与苏尼替尼药物耐受相关的肾细胞癌特异性高表达lncRNA。 接下来，对lncARSR的结构进行研究，包括Northern Blot验证表达；RACE确定全长；编码潜力分析及定位研究，结果发现lncARSR是个长度为591bp，受外膜包裹，其表达水平与药物耐受相关的lncRNA。

lncARSR的鉴定和它对舒尼替尼耐药性的影响

2. lncARSR与临床样本结合

为了检测lncARSR是否能在胞外环境中存在，研究人员在RCC细胞系培养基（CM）和病人血浆进行了检测。结果显示，CM中的表达与细胞中的表达相关；血浆中的表达和组织中的表达相关。同时对lncARSR进行了生存曲线分析和药物敏感性相关性分析，结果发现，lncARSR高表达病人在苏尼替尼治疗后会表现出较差的治疗效果和较短的生存过程。因此，lncARSR在组织中的表达情况也是药物治疗是否有效的预测因子。

LncARSR在肾癌患者血浆和肿瘤组织中的表达水平与苏尼替尼反应相关

3.  LncARSR的运输途径

LncARSR与肾癌耐药性有关，这在模式研究和临床上都得到了印证。特别在血液样品中lncARSR可以作为苏尼替尼是否有效的预测因子。作为分子标志物，威九国际希望它稳定，那么它的运输途径是什么呢？能否保证lncARAR在血液中的稳定性呢？是直接游离的，还是包膜包裹的呢？ 研究通过RNase和Triton-X-100处理， 发现只有在两种试剂都处理情况下才会降低，暗示lncARSR是受外膜保护的。通过分离CM中的外泌体，研究人员发现lncARSR广泛存在。另外，抗药细胞系外泌体中也高表达lncARSR。LncARSR是否是特异性的包装到外泌体中呢？通过RNA pull down和RIP实验表明hnRNPA2B1（已报道和外泌体包装相关）能结合lncARSR。通过在抗药细胞系中敲降hnRNPA2B1，发现外泌体中的lncARSR减少。因此，hnRNPA2B1参与lncARSR的外泌体装配过程。

包含在外泌体中的lncARSR以hnRNPA2B1介导

细胞分泌外泌体，通过与受体细胞结合传递信号，影响细胞的活性。因此，研究人员进行了共培养实验。结果显示，只要有一个细胞中存在高表达的lncARSR，并能正常分泌外泌体，共培养后本来不抗药的细胞系也会存活下来。因此，抗药细胞可以通过在外泌体中传递lncARSR影响相关细胞的抗药性。

Axl和c-Met恢复了舒尼替尼耐药表型

4. LncARSR上游功能机制研究

舒尼替尼作为一种受体酪氨酸激酶抑制剂，通过对lncARSR的生物信息学分析，研究人员发现在其启动子区域有FOXO1和FOXO3a的结合位点。验证实验表明，持续的激活FOXO1或FOXO3a可以明显减低lncARSR的表达。ChIP实验也表明FOXO1或FOXO3a能够结合到lncARSR的启动子区域。已有研究表明，AKT可以诱导磷酸化和胞质停留而调控FOXO家族的蛋白降解过程。敲降AKT后发现，lncARSR的表达受到抑制。因此，AKT通过激活FOXO1和FOXO3a，上调lncARSR，影响了肾细胞癌的药物抗药性。

lncARSR启动子区的结合位点及Chip富集实验

5.  LncARSR下游功能机制研究

已有研究表明，RTKs（受体酪氨酸激酶 AXL和c-MET）与药物耐受相关。lncARSR敲降后发现AXL和c-MET的表达会在降低，而在抗药模型中，AXL和c-MET的表达比较高。当敲降AXL和c-MET后会抵消掉lncARSR敲降对药物敏感的恢复。当用AXL和c-MET的小分子抑制剂BMS777607处理，也能恢复lncARSR高表达引起的抗药性。因此，AXL和c-MET位于lncARSR下游调控苏尼替尼抗药性。

AXL和c-MET位于lncARSR下游调控苏尼替尼耐药性验证

通过生物信息学分析和实验验证，发现lncARSR通过miR-34和miR-449调控对AXL和c-MET。RIP和荧光素酶报告实验表明miR-34/449确实能结合到lncARSR，影响其表达。而当lncARSR敲降后，AXL和c-MET的表达也会因为miR-34a的增多而表达下降。因此，lncARSR通过ceRNA机制，借助miR-34/449来影响AXL和c-MET的表达。

RIP和荧光素酶报告实验验证lncARSR的ceRNA功能

6. 动物实验充分证明lncARSR作为耐药靶点的可行性

采用LNA技术（锁核酸）处理抗药性细胞移植小鼠。结果显示，药物敏感性恢复，肿瘤慢慢变小。进一步检测也显示，AXL和c-MET表达降低。进一步的体内实验和BSM777607处理也显示，苏尼替尼抗药性会得到恢复。因此，靶向lncARSR或者AXL和c-MET能够作为潜在的苏尼替尼抗药病人治疗靶点。

动物实验验证lncARSR作为耐药靶点的可行性

参考文献：Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA. Cancer Cell.2016.