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Problem

NORAD如何结合Pumilio蛋白并调控基因的表达？ 

Abstract

        本文发现一种高度保守且大量存在于细胞质中的lncRNA（NORAD）的序列是由多个重复序列组成，且其序列上至少有17个Pumilio蛋白（含PUM1和PUM2两种异构体）的结合位点，NORAD通过结合PUM1和PUM2蛋白调节它们靶向的mRNA的表达。这种通过调控与之结合的蛋白的活性来控制基因表达的方式成为一些胞质lncRNA的功能方式之一。  

Background

  lncRNA是一类长度大于200nt的非编码RNA，在多种生命过程起重要的调控作用。大部分lncRNA产生后会通过细胞膜游离到细胞质中，这类胞质lncRNA的结构特征和作用方式尚不清楚。

         Pumilio蛋白家族可作为一种转录调控因子，调控3’-UTR区含有Pumilio识别元件（PRE）的mRNA的转录和表达，真核生物的Pumilio蛋白家族高度保守并参与神经系统活动、EPK信号通路、胚胎发育等生命活动。人类Pumilio蛋白家族有PUM1和PUM2两种异构体。

Methods

1. 实验材料：U2OS细胞系和Hela细胞系（U2OS是人骨肉瘤细胞，Hela是人子宫颈癌细胞）

2.  FISH、RNA pulldown、RIP、WB、MS、siRNAs沉默、qRT-PCR、RNA-seq、荧光素酶反应等

Results

1. NORAD 高度保守且存在于细胞质，属于非编码RNA

通过与多种哺乳动物EST和 RNA-seq数据库比对，发现NORAD基因（noncoding RNAactivated by DNA damage）转录产生的lncRNA（本文将其命名为NORAD）序列高度保守，5.3kb长的NORAD序列始于一个CpG岛，止于一段poly(A)。FISH结果显示NORAD定位在细胞质中，且每个细胞约有70个NORAD转录本。

利用PhyloCSF、Pfam/HMMER软件，和CPAT、CPC分析方法对NORAD序列进行编码能力预测，结果显示NORAD属于非编码RNA。

Figure 1 | Overview of the human NORADlocus. (a) Genomic neighbourhood of NORAD. CpG island annotations and genomicdata from the ENCODE project taken from the UCSC genome browser. (b) Supportfor the NORAD transcription unit. Transcription start site information takenfrom the FANTOM5 project45. Polyadenylation sites taken from PolyA-seq dataset46. ENCODE data sets and repeat annotations from the UCSC browser.(c)Predominantly cytoplasmic localization of NORAD by smFISH. Scale bar, 10 mm.

2. NORAD含有至少12个结构重复单元

序列结构分析显示，NORAD至少含有12个结构重复单元，大部分哺乳动物的NORAD序列都是如此，约3.5kb的序列串联有12个重复单元，每个单元约300nt。对其中一个单元（repeated unit 7）进一步分析发现，这些重复单元有5种结构特征，即1或2个PRE、4bp的茎环结构、U-rich区域、8-9nt的茎环结构、A/G-rich区域。

3. NORAD含有多个Pumilio蛋白的结合位点

作者挑选重复单元P8和P9进行RNA pulldown、western blot和质谱检测，发现P8和P9结合有PUM1和PUM2蛋白，当突变处理 P9的PRE区域时，结合的PUM1或PUM2蛋白大量减少。说明PRE区域是NORAD结合Pumilio蛋白的关键位点，RIP实验结果显示NORAD结合PUM2多于结合PUM1且至少有17个结合Pumilio蛋白的位点。因此，每个细胞大约能结合1200个Pumilio蛋白。

4. NORAD表达量变化会影响Pumilio蛋白与靶标序列的结合

作者对U2OS细胞进行敲除PUM1/PUM2和过表达PUM1/PUM2并用qPT-PCR和测序方法检测3’UTR含PRE序列的表达量，结果证实Pumilio蛋白靶向的序列有明显的特征，即其3’UTR区有Pumilio识别序列UGUANAUA（PRE）。随后，作者用siRNA抑制NORAD的表达或克隆NORAD使其过表达，当NORAD表达下调时，Pumilio蛋白靶向的基因（3’UTR区含有PREs）相对于参照组（不含PREs）基因更多基因表达量下调，反之亦然。

5. NORAD通过识别PREs来调控基因表达

           作者通过荧光素酶反应验证了NORAD是通过识别PREs来调控Pumilio蛋白家族的活性，进而影响Pumilio蛋白靶向的基因的表达水平。

          最后，作者表示对于NORAD上其他一些重复结构的功能还很感兴趣，尤其是两处茎环结构，也许这些区域会结合其他蛋白，或者和Pumilio蛋白存在互作作用。之前Mendell团队研究发现NORAD通过调控Pumilio蛋白家族的活性控制了染色体分离，在NORAD的功能方面还可以持续研究。

参考文献：A conserved abundant cytoplasmic long noncodingRNA modulates repression by Pumilio proteins in human cells. Naturecommunications. (2016), DOI: 10.1038/ncomms12209.