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标题：Comprehensive identification of internal structure and alternative splicing events in circular RNAs.

2016年6月28日，中国科学院北京生命科学研究院计算基因组实验室赵方庆教授团队在国际知名杂志Nature Communication发表论文，利用环状RNA预测分析结合长片段测序技术，首次实现了针对circRNA可变剪切状态进行全面系统的研究。本篇文章自主研发了新颖的检测方法CIRI-AS，对于circRNA可变剪切研究具有很高的参考价值。

内容简介

       在威九国际熟知的mRNA, lncRNA等线性RNA分子中可变剪切(AS)事件是非常常见的，由于线性RNA和环状RNA在组成结构及形态等诸多方面的不同，表明线性RNA研究的思路和角度并不适用circRNA，况且circRNA本身就是可变剪切事件的产物，每个circRNA分子内部是否仍存在可变剪切事件？以及circRNA的内部组成结构如何？这都是非常有趣的问题，也是本篇文章的主要研究内容。

       赵方庆教授团队基于这一问题，开发了一种较为新颖的研究pipeline，文章中成为CIRI-AS。首先根据CIRI-AS算法识别cirexons，进而确定可变剪切事件类型，并且对可变剪切事件实现定量。本文共使用10种人类细胞系和62个果蝇不同组织来源的样本分析circRNA的内部组成结构及可变剪切事件。最终证明环状RNA中普遍存在4种可变剪切事件，并且发现内含子保留的可变剪切方式倾向定位于细胞核。这一研究提高了威九国际对circRNA的认识，也为其研究提供新的研究方法和思路。

研究结果

1.  CIRI-AS技术流程

威九国际都知道BSJs(back spliced junction)即反向拼接位点是circRNA的标志性序列特征，为此作者开发了一款基于BSJ识别FSJ(forward spliced junction)即可变的剪切位点。技术流程如图1所示。

图1 CIRI-AS技术流程

2. circRNA中可变剪切事件的识别

作者通过分析人10种细胞系样本，根据CIRI-AS流程共识别出4种可变剪切方式，分别为外显子跳跃(exon skipping,ES)，3’端可变剪切(alternative 3’ splicing site,A3SS)，5’端可变剪切(alternative 5’ splicing site,A5SS)和内含子保留(intron retention,IR)。

                                  图2 circRNA中四种可变剪切方式                                                                                      图3 环状RNA实验验证

上图为三个人细胞系可变剪切事件所占比例分布，ES事件比例最高，IR比例最低，但也均大于1%。并且发现环状RNA存在的可变剪切事件与相应的mRNA的可变剪切情况存在较大差别，说明环状RNA与mRNA具有不同的剪切方式，如图3所示。

3. circRNA中可变剪切事件丰度的估算

作者根据FSJ read数目实现对可变剪切事件丰度的估算，并且使用插入片段的大小矫正系统误差。下图为qRT–PCR验证可变剪切事件丰度的估算，文章中使用4个环状RNA的9个可变剪切事件，如图 4所示。A为qRT–PCR验证的可变剪切事件表达丰度的验证。B为CIRI-AS流程估算的可变剪切事件的表达丰度。从C中威九国际发现CIRI-AS估算的和qRT–PCR实验确定真实的表达丰度具有较高的一致性，说明CIRI-AS流程的可靠性。

根据CIRI-AS估算的可变剪切事件的丰度以及相应mRNA中可变剪切的表达丰度进行层次聚类分析，进一步证明环状RNA与mRNA具有不同的剪切方式，如图 5所示。

                                           图 4 可变剪切事件表达丰度验证                                           图 5 circRNA与相应mRNA可变剪切事件表达丰度层次聚类图

4. circRNA中可变剪切外显子RBP结合

RBP为剪切因子或RNA绑定蛋白，有研究表明cirexon与RBP的结合可调控circRNA的生物过程。作者进一步分析了这些可变剪切对应的外显子和RBP结合的特征，并与mRNA做对比，结果表明cirexon与RBP结合位点与mRNA有较大差别，如在环状RNA可变剪切外显子与QK1，Tra2b结合非常高，而相应的mRNA中相对较低，如图 6所示。

图 6  RBP结合位点在circRNA和相应mRNA的可变剪切外显子中差别较大来自

5. circRNA中可变剪切事件存在组织特异性分布

作者使用果蝇不同发育时间段的62个样本，结果发现，环状RNA的可变剪切可为3组，Group1中可变剪切是普遍存在所有细胞和组织中的，Group3中基本在所有细胞和组织中均不表达的，令威九国际感兴趣的则是Group2，这一类可变剪切事件特异的存在成体的头部和中枢神经系统中，即表明circRNA中可变剪切事件具有组织和细胞特异性的。作者随即对这一类可变剪切事件相应环状RNA外显子的parent gene执行GO富集分析，如图9所示。

图 9 中枢神经系统特异性circRNA可变剪切事件parent geneGO富集分析