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Q1：转录组测序相比其他检测方法(如芯片检测、EST文库法等)的优势是什么？

A1：1）可以对任意物种进行全转录组分析，无需预先设计特异性探针，无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，并且避免了芯片杂交存在的交叉反应和背景噪音。

2）覆盖度很高，深度测序可以检测到几乎所有的转录组片段序列，能够发现未知基因。

3）检测范围广，能够对几个到几十万个拷贝精确计数，实现正常和稀有转录本的定量。

4）分辨率很高，可以检测基因家族中相似基因及可变剪接造成的单碱基差异。

Q2：转录组测序对样品有什么要求？

A2：二代测序平台可以检测真核/原核常规样本，也可检测Single cell、FFPE等特殊样本。对于常规样本，total RNA总量一般不低于200ng，浓度不低于20ng/μg；避免蛋白、胍盐、酚类等污染，样品完整性越好，测序分析结果越好。

Q3：转录组建库过程中使用什么引物做反转录？

A3：常规建库采用随机引物进行反转录，如有特殊要求可采用oligo(dT)或者两种都采用。

Q4：链特异性文库是指？

A4：链特异性文库是指利用UNG酶法构建的文库，建库时在合成cDNA二链时引入dUTP，加上测序接头后，用UNG酶特异水解cDNA二链，使得测序模板仅为cDNA一链。通过链特异性文库测序能够区分转录本的正负链，确定转录本的来源，从而更精确的统计转录本的数量，避免假阳性和假阴性，使基因结果和表达调控等研究更加可信。

Q5：转录组测序需要多少数据量？

A5：测序数据量与物种基因组大小相关，对于已有参考基因组的物种，可对转录组大小进行初步评估；对于无参考基因组的物种，可以参考临近物种的转录组大小。一般而言，小物种测4-6Gb，基因组较大较复杂的物种可测6-10Gb。

Q6：转录组测序后有何验证方法？

A6：转录组测序后可通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术来验证测序结果。

Q7：转录组测序为何需要生物学重复？

A7：生物体的基因转录过程存在时间和空间的特异性，如果不设生物学重复，分析得到的结果有随机性，并可能被高影响因子的杂志拒稿。目前的转录组分析至少需要2次生物学重复。