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Q1：如何分离得到Small RNA？ 

A1：Small RNA长度在50nt左右，一般使用PAGE 胶分离不同片段大小的 RNA后，切胶回收18-30nt或18-40nt的条带，即可得到大部分的Small RNA。 

Q2：Small RNA文库构建失败的原因有哪些？ 

A2：建库成功与否与样品质量关系很大，如果样品总量低、质量差，或是样品中 Small RNA 含量低于常规含量等，均易导致建库失败。另外，建库人员的操作失误、试剂过期等原因也会导致建库失败。 

Q3：Small RNA信息分析是否需要提供物种的参考基因组？ 

A3：能够提供参考基因组最好，如果该物种没有参考基因组序列，也可提供近源物种的参考基因组序列或该物种的EST等序列，并且需要提供相关的exon/intron,repeat 信息以及基因编码序列。 

Q4：原始数据中为何会存在3’接头序列、5’接头污染？ 

A4：基于HiSeq平台SE50策略测序得到的序列长度为49nt，而Small RNA序列长度是18-30nt，故测序得到的序列上有一段3’接头序列。5’接头污染指的是5’接头分子，由于加接头时接头分子都是过量加入的，因此会有空载现象，造成数据中含有少量的5’接头序列污染。通常污染的比例不高，属于正常现象。 

Q5：为什么不同的样品测序得到的 reads 数量相差较大？为什么说不影响分析准确性？ 

A5： Small RNA 在不同物种，以及同一物种不同组织或不同发育阶段表达情况都有差异，通常用作 total RNA 提取的材料的细胞数差异也很大（通常为 10～100 万个细胞），所 以取材的时空及细胞总数的多少决定了样品中表达的 small RNA 的总量不可能完全一致。 Reads 数与样品上机浓度，样品 GC 含量，样品自身特性相关，不同样品间存在的差异是正常的。 reads 数只会影响到数据量，数据量足够分析就可以，不影响准确性。同时，威九国际分析时采用标准化后的数据，这样即使 reads 数量相差较大，也不影响分析的准确性。 

Q6：为什么实验结果中会存在降解的 mRNA 序列？ 

A6：由于total RNA 常发生轻微的降解，而生物体内也有自然的降解过程，因此数据中就会含有小部分 mRNA 降解片段。但通常这个比例很低，并且取决于样品 total RNA 的质量。