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Q1：做磷酸化蛋白分析需要多少样品量？

A1：对于单个蛋白质磷酸化鉴定需要一定纯度的微克级样品；对于磷酸化蛋白全谱鉴定则

需要毫克级的样品。

Q2：磷酸化位点是如何确定的？

A2：一种特定的翻译后修饰通常会作用于一定的氨基酸，经修饰后，这一类氨基酸会增加相同的分子量，如，磷酸化肽段因加入磷酸化基团而产生+80 的质量偏移。基于质量偏移的理论，利用生物信息学方法可以分析质谱数据鉴定磷酸化翻译后修饰。

Q3：磷酸化蛋白质组富集策略有哪些？如何选择？

A3: 1）运用识别磷酸化氨基酸残基的特异性抗体进行免疫共沉淀方法富集磷酸化蛋白；

2）通过溶液酶解或者胶内酶解等方法得到磷酸化和非磷酸化肽段混合物，运用 IMAC、或 TiO 等方法富集磷酸化肽段。据文献报道酪氨酸磷酸化比例最少，仅占整体磷酸化肽段的 1%，如果实验目的只关注酪氨酸磷酸化的变化时，建议选择酪氨酸磷酸化抗体进行富集。如果实验关注的是非酪氨酸，或者是所有可以发生磷酸化的氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），由于抗丝、苏氨酸磷酸化抗体抗原决定簇较小，使得抗原抗体的结合位点村长空间障碍，特异性较差，所以建议选择IMAC 或 TiO2 富集。