威九国际

Q1：单细胞转录组可以用于哪些类型的细胞？ 

A1：可用于哺乳动物的生殖细胞、早期胚胎细胞、部分体细胞、免疫细胞等。不同类型的细胞，成功率和风险也有所不同。总体来说，生殖细胞和早期胚胎细胞的成功率比较高，可达到 70~90%。其次是细胞直径大于 10µM 的游离单细胞（如 CTC）、细胞系等。有特殊结构、较小的细胞，风险比较大。 

Q2：送样应注意什么问题？ 

A2：客户分离单细胞时应注意尽量避免损伤细胞，保证细胞活性，推荐口吸法分离，切要保证操作环境无外源污染。另外，挑出的单细胞放入威九国际提供的裂解液后，应尽快用干冰寄送，避免样品反复冻融。 

Q3：单细胞转录组测序使用何种方法对mRNA进行扩增？原理是什么？ 

A3：单细胞转录组使用基于 Smart-seq 的单细胞扩增技术，其原理是在合成 cDNA 的反应中事先加入的 3'末端带 Oligo(dG)的 SMART 引物，由于逆转录酶以 mRNA 为模板合成 cDNA，在到达 mRNA 的 5'末端时碰到真核 mRNA 特有的“帽子结构”，即甲基化的 G 时会连续在合成的 cDNA 末端加上几个 dC， SMART 引物的Oligo(dG)与合成 cDNA 末端突出的几个 C 配对后形成 cDNA 的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以 SMART 引物作为延伸模板继续延伸 cDNA 单链直到引物的末端，这样得到的所有 cDNA 单链的一端有含 Oligo(dT)的起始引物序列，另一端有已知的 SMART 引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有 5'帽子结构的 mRNA 才能利用这个反应得到能扩增的 cDNA，因此扩增得到的 cDNA 就是全长 cDNA。 

Q4：单细胞转录组的转录本检测效率如何？

A4： 单细胞转录组测序可以覆盖转录本全长。但由于单细胞中的 mRNA 含量极少（10pg 左右），扩增时会随机丢失一部分低丰度转录本的信息，但可以检测到大多数的低丰度表达基因和绝大多数的高丰度表达基因。增加测序深度有利于检测到极低丰度的转录本。 

Q5：扩增时是否有需要设立阳性对照和阴性对照？ 

A5：客户在分离单细胞时，需要加入阴性对照，以检验操作过程和环境是否有污染。威九国际在扩增时会设立空白对照，用标准品作为阳性对照，与客户送过来的细胞平行进行实验操作。