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m6A检测技术主要包括两种角度，一种是从整体上检测m6A水平，另一种是通过高通量测序的方法大规模检测m6A。其中LC-MS/MS和比色法能够检测RNA整体的m6A水平，但无法满足大规模的基因检测以及整个转录组水平分布的m6A研究要求，更不能确切的定位甲基化位点。meRIP-seq（即威九国际常说的m6A-seq）和miCLIP-seq属于高通量测序手段，其中miCLIP-seq可以精确到单碱基甲基化分辨率，但实验难度大，实验成本高。

LC-MS/MS的原理是根据m6A和总腺嘌呤的比例算出样品RNA上整体的m6A甲基化程度。具体实验步骤如下：

Step1. 第一步使用TRIzol提取完Total RNA后，可以用oligo dT磁珠对mRNA进行富集，也可以使用rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA；

Step2. 第二步使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA从单链消化成单个核苷酸；

Step3. 第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时，核苷酸消化成核苷，将样本注射入液相色谱仪，根据出峰的保留时间面积计算各个碱基的含量；

Step4. 第四步进入质谱串联分析，单个核糖核苷会被离子化，同时被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤，最后根据出峰的保留时间计算m6A的面积；

最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。即：样品整体m6A水平=质谱检测m6A含量/液相色谱检测总A含量。

比色法的原理是根据附着在m6A的荧光强度推算m6A在mRNA中的比例。该方法与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m6A甲基化水平。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便，很多实验室都有条件和能力完成。

miCLIP-seq的原理是利用m6A抗体富集m6A修饰，配合紫外交联技术，在全基因组范围鉴定单碱基水平的m6A修饰。实验步骤如下：

Step1. 对富集完的RNA（oligo dT磁珠或rRNA去除试剂盒）进行片段化；

Step2. 使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的RNA片段进行结合；

Step3. 在紫外线交联之后，抗体-RNA复合物共价结合，用proteinA/G亲和提取回收，SDS-PAGE和硝化纤维膜印迹；

Step4. 用蛋白酶K将RNA从膜上释放，进行反转录，在RNA逆转录为cDNA时遗留在RNA上的肽段会阻止转录或特异性突变，导致核苷酸整合错误(表示为C→T转化)和cDNA截断；

Step5. 然后构建测序文库上机测序。

meRIP-seq又被称为m6A-seq，原理是利用m6A抗体富集含有m6A的RNA片段，然后对富集的片段进行测序。实验步骤如下：

最后总结下这4种技术的比较，大家可以根据自己的需求和条件选择合适的技术来满足研究目的。