全转录组测序是指对某一物种或者特定细胞在特定生理条件下产生的所有转录本进行收集并测序,包括mRNA和非编码RNA(Non coding RNA)。非编码RNA对编码RNA的转录及转录后、翻译等过程具有重要的调控作用,其研究主要集中在Small RNA、lncRNA和circRNA,各种RNA之间形成庞大的调节系统,共同调控生物体的生命过程。
全转录组测序不仅得到每种RNA的全套分析结果,还可通过多重关联分析有效地缩小目标基因的范围,准确地得到关键功能基因。使用同一批样本进行多种RNA测序,分析结果的可比性更强,通过结构互作分析和差异表达分析诠释可能存在的ceRNA机制,深入阐述生物学问题。

图1 全转录组测序分析流程图

图1 ceRNA机制示意图
经典案例
全基因组范围筛选和功能分析鉴定大量的产量相关的水稻lncRNA Genome Biology.2014.
Genome-wide screening and functional analysis identify a large number of long noncoding RNAs involved in the sexual reproduction of rice. Genome Biology.2014, doi: 10.1186/s13059-014-0512-1.
本文通过对水稻雄蕊、雌蕊、授粉5天后的种子和发芽14天后的嫩枝4个组织构建链特异文库、测序,结合水稻数据库中已有的35个样品的数据,全面分析水稻lncRNA 的结构特点及lncRNA与mRNA的ceRNA关系。作者共分析得到2224个水稻lncRNA,这些lncRNA与拟南芥及哺乳动物的lncRNA有所不同,且具有很强的组织及时空表达特异性。结合位点是miR160及miR164的ceRNA对也被发现,对应的lncRNA是XLOC_063639与XLOC_007072。分析结果还显示XLOC_057324(lncRNA)与水稻产量有重要关系。

图1 水稻lncRNA的结构特征


图2 水稻lncRNA的表达特异性及qPCR验证结果

图3 水稻ceRNA机制
推荐文献
[1] Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy. Nat Rev Genet. 2016, doi: 10.1038/nrg.2016.20.
[2] The BRAF pseudogene functions as a competitive endogenous RNA and induces lymphoma in vivo. Cell. 2015, doi: 10.1016/j.cell.2015.02.043.
[3] Competing endogenous RNA: A novel posttranscriptional regulatory dimension associated with the progression of cancer. Oncol Lett. 2015, DOI: 10.3892/ol.2015.3698.
[4] Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation.2014, doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.003863.
[5] Emerging roles of competing endogenous RNAs in cancer: insights from the regulation of PTEN. Mol Cell Biol. 2013, doi: 10.1128/MCB.00683-13.
[6] A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language? Cell. 2011, doi: 10.1016/j.cell.2011.07.014.
测序策略
产品类型 | 建库类型 | 测序策略 | 建议数据量(Clean data) | 周期 |
mRNA+miRNA关联分析 | mRNA常规文库
Small RNA文库 | mRNA :Illumina HiSeq,PE100,PE150
miRNA :Illumina HiSeq,SE50 | mRNA 4Gb以上,miRNA10/20M clean reads | 50工作日 |
mRNA+miRNA+lncRNA/circRNA关联分析 | 链特异性文库
Small RNA文库 | mRNA+lncRNA/circRNA:PE100,PE150
miRNA :Illumina HiSeq,SE50 | mRNA+lncRNA 10Gb
miRNA10/20M clean reads
circRNA最少5Gb,推荐8-10Gb | 55工作日 |
送样建议
样品类型 | 总量 | 浓度 | 其他要求 |
动植物等有参物种Total RNA | 4μg | 50ng/μL | RIN>8.0,28S/18S≥1.5,图谱基线无上抬,5S 峰正常。 |
新鲜动物组织干重 | 350mg | / | / |
新鲜植物组织干重 | 350mg | / | / |
新鲜培养细胞数/菌体 | 2×107个 | / | / |
全血 | 5mL | / | / |
FFPE样本 | 100mm2,10μm厚的切片5片以上 | / | / |
FAQ
全转录组关联分析常见问题